如前文所说，小核酸药物的市场发展潜力巨大，药物发展迅速，自身优势巨大，例如临床研发周期短、候选靶点丰富、高特异性、治疗领域更广等。

        但...事实上，一些限制因素如易被核酸酶降解､系统给药后进入细胞内传递到靶部位效率低以及潜在的不良反应，如肾小球肾炎､血管炎和血小板减少等，使其应用于临床受到一定的限制。目前，在药物的研发上，小核酸药物的研发还是存在一定的技术壁垒和研发难点，其中包括序列的优化和化学修饰、递送技术以及工艺放大。其中，原料药合成过程中的化学修饰技术和制剂工艺中的递送技术是小核酸药物成功的最关键的因素。另外，工业上的制约因素也影响着小核酸药物的上市以及制约着药物在市场上的发展。以下本文将着重介绍一下小核酸药物存在的一些劣势和其技术面对的难点。

序列优化和化学修饰

       小核酸药物序列设计时要同时考虑序列保守性、同源性、免疫原性、脱靶等因素，最终设计出特异性高、有潜在活性的优质小核酸药物。在设计和筛选方面，可借助于生物信息学分析系统和AI药物开发辅助技术等。未经修饰的小核酸药物成药性并不理想，具有较多缺点，比如稳定性差易被降解、很难进入细胞、对靶标mRNA的结合亲和力不佳等。为了提高治疗效果，小核酸药物必须经过化学修饰，目前主要包括骨架、核糖和碱基的修饰：

        骨架修饰：是最基本的化学修饰。其中使用较多的骨架修饰为硫代磷酸，即用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子（P-S替代P-O），可以减少寡核苷酸的亲水性、增加了对核酸酶降解的抵抗力，提高了药物稳定性和半衰期。然而，这类化学修饰在高浓度的情况下可能会导致寡核苷酸和靶标的亲和力下降，从而导致脱靶毒性和炎症反应。

骨架修饰示意图（图片来源于网络）

        核糖修饰：核糖修饰可影响小核酸和靶标RNA的亲和力、对核酶的稳定性以及与RNA结合后的性质。由于RNA和DNA的结构仅差一个2’位的羟基，因此该羟基微小的改变就足以引起显著效应，也决定着RNA糖基部分的构像，最终影响与靶RNA的亲和力。羟基的修饰还可以改变磷酸部分对核酸酶的敏感性，影响药物的体内稳定性。目前，较常使用的修饰是2’-O-甲氧乙基修饰（2’-MOE）。

核糖修饰示意图（图片来源于网络）

        碱基修饰：碱基修饰能够提高小核酸药物的沉默效果。小核酸药物主要通过与mRNA碱基互补形成氢键，从而发挥RNAi的作用，因此通过对碱基的修饰，可以进一步加强碱基之间的相互作用。在尿嘧啶的5位点引入溴或碘是常使用的碱基修饰方法，如5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶，可加强腺嘌呤-尿嘧啶（A-U）之间的连接，提高碱基的相互作用，从而增强对靶标mRNA的效应。

碱基修饰示意图（图片来源于网络）

递送技术

        核酸药物需要顺利到达并进入病变细胞后才可以发挥作用，这一过程需要依靠靶向递送系统。目前，研究比较成熟的递送技术主要包括GalNAc和脂质纳米颗粒（LNP）：

        GalNAc：为N-乙酰半乳糖胺，通过中间酸敏感的化学linker与小核酸药物相连。酸敏感的linker设计可使核酸偶联物在通过内吞体进入细胞之后与偶联物脱离。GalNAc可与肝实质细胞表面的糖蛋白受体ASGPR特异性结合，形成的复合物通过胞吞作用进入肝细胞，此外，ASGPR能以较高的循环速率重复使用，并结合胞外其它GalNAc，最终减少给药剂量。ASGPR仅在肝实质细胞高表达，利用GalNAc递送可精确靶向肝脏，治疗肝部疾病。GalNAc递送是目前应用最成熟的小核酸递送方式，具有结构简单、生产容易、耐受性较高、靶向机制明确等优势，可广泛用于肝部疾病的小核酸药物开发。

GalNAc肝靶向机制（图片来源于网络）

        脂质纳米颗粒（LNP）：LNP是使用脂质形成纳米微粒，结构为磷脂双层组成的囊泡。通过将核酸药物装载到LNP中，可保护被包裹的核酸药物免于降解和清除，并促进其跨细胞膜运输到目标靶位。LNP递送系统主要由4种物质组成：阳离子脂质、中性辅助脂质、胆固醇、聚乙二醇修饰的脂质。阳离子脂质提供正电荷，可与带负电荷的核酸结合。LNP的完全封装保护RNA免受核酸酶消化，可电离脂质和聚乙二醇(PEG)脂质的存在，使LNP在生理pH值中呈中性，减少了血清蛋白的非特异性相互作用。LNP递送技术是核酸药物上市商业化的关键之一，但LNP递送系统的构建拥有较高壁垒，目前全球发展靠前的几家企业，其技术溯源也都是依靠专利授权。LNP的专利主要针对阳离子脂质体结构和四脂组分比例的保护，这是无数核酸药物企业无法绕开的上行专利。

脂质纳米颗粒LNP结构及其递送方式（图片来源于网络）

        其他递送技术：小核酸药物还可以通过其他递送技术实现特定细胞或组织的靶向递送，例如多聚体载体和细胞外囊泡递送技术等。

工艺放大

       小核酸药物生产难度大，CMC要求高，在各环节上均存在较高的技术壁垒，比如合成过程中的化学修饰技术和制剂工艺中的递送技术等是小核酸药物成功研发的关键因素，作为关键物料的核苷单体的质量要求和及时供应等问题是小核酸药物商业化的关键因素。小核酸原料药生产使用固相合成技术，在工艺开发、工艺放大和质量控制上存在较高壁垒，且小核酸原料药固相合成配套设备、洁净环境等前期投入非常大，同时生产需符合GMP要求。其工艺生产较为复杂，核苷基础原料需要先使用化学方法添加保护基团，然后在固相合成仪上经过20+22个循环将原料逐一连接，形成21个碱基正义寡核苷酸链和23个碱基的反义链寡核苷酸。这一系列过程总收率并不高，同时还会产生大量的副产物和杂质，因此合成的寡核苷酸链反应完成后，需要通过工业化的液相色谱系统对产品进行分离纯化。此外，核苷单体是小核酸原料药的关键物料，符合质量要求的核苷单体及时供应是小核酸药物商业化的关键因素。全球仅有为数不多的合格供应商，近年来核酸类药物和诊断试剂的开发对核苷单体的需求急剧增加。

siRNA 原料药生产工艺流程图（图片来源于网络）

        除了自身技术上的壁垒和难点，小核酸药物在行业上还存在一定的制约因素：

生产工艺开发难度大，规模化生产对供应链要求高    

       小核酸药物工艺流程非常复杂，涉及核苷单体、原料药及制剂的生产。其中，核苷单体生产涉及多个技术环节，在纯度、杂质控制、自动化、批量等多方面均有复杂的工艺要求，需要长时间的技术积累。其次，小核酸原料药生产使用固相合成技术，在工艺开发、工艺放大和质量控制上存在较高壁垒，固相合成配套设备、洁净环境等前期投入非常大；另外，核酸类杂质结构非常近似，分析及控制是一大难点。由于国内有能力生产核苷单体、小核酸原料药的企业较少，相关产业配套不完善，随着市场需求的增加，能否保证小核酸药物产品及时供应成为小核酸药物开发和商业化成功的挑战之一。

小核酸药物价格高昂，销量受经济水平限制

        目前中国市场上暂无获批的小核酸药物，但是美国市场小核酸药物价位却是高昂。2020年11月23日，美国FDA批准了Alnylam公司罕见疾病药物Oxlumo的上市。同年11月19日，欧盟委员会（EC）也批准了该药的上市，这也成为该公司第三次推出RNA干扰（RNAi）类药物。Alnylam准备将该药的平均价格定为每名患者每年49.3万美元，并且预计每名患者的净价格将在每年38万美元左右。2019年11月20日，FDA批准Alnylam公司Givlaari（givosiran）上市用于治疗患有急性肝卟啉症（AHP）的成年患者。Givlaari定价为每年57.5万美元，打折后44.2万美元。和第一个上市的Onpattro一样，Givlaari将根据患者受益程度调整价格。

靶向性差+脱靶效应+稳定性差，是制约国内企业研发的三大痛点

       国内小核酸研发企业仍然面临三大技术痛点，但是国外企业的在技术方面已实现较好的突破。三大痛点主要包括以下三点：

（1）靶向性差：siRNA是带负电荷的生物活性大分子，不具备对组织或细胞的靶向能力，穿透细胞膜的能力极差。

（2）脱靶效应严重：siRNA的正义链能介导同源基因的表达沉默，引起由正义链介导的脱靶效应。另外，理论上，小核酸只有在反义链和目标信使RNA完全配对才会起到治疗作用。然而，序列上小部分的不匹配也可能导致其它的基因沉默，造成脱靶效应，产生毒副作用。

（3）稳定性差：RNA在人体循环系统中容易被血液核酸酶降解，稳定性较差。

       小核酸药物有着自身的天然优势，但很遗憾的，也有着天然的缺陷和客观的制约。但...（这里还是但）随着技术的发展，一些技术壁垒和难点将会被攻克，而随着壁垒的打破和技术的攻克，行业的制约也可能会得到缓解。小核酸药物到底是上将潘凤还是人中吕布，目前还不得而知，也有待时间的验证，但不可否认的是，小核酸药物的潜能是巨大的，也将会推动新药发展的第三波浪潮，可拭目而待 。

PS：图片仅为图片，不代表任何观点。

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